分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)—凝膠電泳、成像篇
上海颯凌電子 2020-5-15
瓊脂糖凝膠電泳原理
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。
瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),分子通過時(shí)會(huì)受到阻力,大分子物質(zhì)受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,而且還取決于分子大小。
DNA 在堿性條件下(緩沖液pH8.0)帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng),不同DNA 篇段由于分子和構(gòu)型不同,在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也不同。核酸染料可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物,經(jīng)紫外線照射后,可分出不同的區(qū)帶。
哪些因素會(huì)影響DNA分子的遷移速率呢?
DNA 的分子大小
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA篇段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA篇段大小介于兩者間所需膠濃度為0.8-1.0%。
DNA分子構(gòu)象
DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)很快,而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)慢。
電源電壓
在低電壓時(shí),線狀DNA篇段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加,不同分子量的DNA篇段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA篇段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。
嵌入染料的存在
染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低。
離子強(qiáng)度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。
因此,在實(shí)際電泳過程中需要充分考慮以上幾種因素,選擇合適的電泳條件,從而達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
凝膠電泳過程中所用到的實(shí)驗(yàn)器具及試劑主要有:
水平電泳儀,恒溫水浴鍋/微波爐,移液器,緩沖液,瓊脂糖,核酸染料,DNA Ladders
實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 安裝電泳槽,準(zhǔn)備制膠
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及目的,選擇合適的制膠板及梳子。
2. 制備瓊脂糖凝膠
根據(jù)DNA的篇段大小,選擇瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中的比例。稱取瓊脂糖置于緩沖液中,選擇水浴鍋或者微波爐加熱至*溶解,并搖勻。
3. 灌膠
將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4. 待瓊脂糖凝固后,在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液,拔出梳子。
5. 加樣
將DNA樣品與加樣緩沖液按比例混勻后,用移液器加到樣品槽中。
6. 電泳
安裝好電極導(dǎo)線,打開電源,調(diào)節(jié)電壓3-5V/cm,當(dāng)溴酚藍(lán)到距凝膠前沿1-2cm時(shí),停止電泳。
7. 染色和觀察
取出凝膠,放進(jìn)含有核酸染料的稀釋液中(按說明書要求稀釋,或者在制膠過程中加到凝膠內(nèi))染色,在紫外或者藍(lán)光燈下觀察。
在實(shí)驗(yàn)過程中需要注意一下內(nèi)容:
(1)凝膠成像系統(tǒng)的選擇:成像產(chǎn)品主要可以分為藍(lán)光系統(tǒng)和紫外系統(tǒng)。
藍(lán)光切膠儀的光源為藍(lán)光,發(fā)射波長(zhǎng)為470nm,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及樣品的損害較小。適用于一些安全染料,如:SYBR Safe、SYBR Green I 等。
紫外光源適用于所有染料,254nm、365nm、312nm 三種不同的波長(zhǎng)可選擇。
(2)DNA Ladders 的選擇:所擴(kuò)增的片段應(yīng)在DNA Ladders的指示范圍內(nèi),否則無法起到指示作用。